USP 788 không có một phép thử duy nhất mà có hai: Phương pháp 1 đếm bằng che sáng và Phương pháp 2 đếm bằng kính hiển vi sau khi lọc mẫu qua màng. Nhiều hồ sơ kiểm nghiệm ở Việt Nam chỉ mô tả Phương pháp 1, coi Phương pháp 2 là chuyện của phòng thí nghiệm bên ngoài. Nhưng dược điển đặt hai phương pháp ở hai vai trò rất khác nhau — và điều ít được để ý nhất là giới hạn chấp nhận của chúng không giống nhau: cùng một lọ thuốc 50 ml, ngưỡng của Phương pháp 2 chỉ bằng một nửa Phương pháp 1. Bài viết đối chiếu hai phương pháp theo trình tự áp dụng, giới hạn, và những gì thay đổi trong phòng lab khi buộc phải chuyển.
Hai phương pháp, một trình tự
Phương pháp 1 — đếm hạt bằng che sáng (light obscuration). Mẫu lỏng được rút qua một cảm biến quang học; mỗi vật thể đi qua chùm laser làm giảm lượng ánh sáng tới đầu thu, biên độ giảm được quy ra cỡ hạt. Máy đếm tự động, cho kết quả trong vài phút, và đếm được số lượng lớn hạt ở nhiều ngưỡng cỡ.
Phương pháp 2 — đếm hạt bằng kính hiển vi. Mẫu được lọc qua màng lọc, hạt bị giữ lại trên bề mặt màng, rồi kiểm nghiệm viên soi màng dưới kính hiển vi với hệ chiếu sáng phù hợp và đếm thủ công, so kích thước với thước chuẩn có sẵn trong thị kính để phân loại hạt ≥10 µm và ≥25 µm.
Trình tự dược điển quy định rất rõ: Phương pháp 1 là phép thử áp dụng trước. Phương pháp 2 được dùng khi Phương pháp 1 không áp dụng được — chứ không phải khi người làm muốn có con số đẹp hơn. Đây là điểm hay bị hiểu ngược.
Giới hạn chấp nhận khác nhau ra sao
Đây là bảng mà mọi hồ sơ nên có nhưng ít khi có đủ bốn ô:
| Dạng bao bì | Ngưỡng cỡ hạt | Phương pháp 1 (che sáng) | Phương pháp 2 (kính hiển vi) |
|---|---|---|---|
| Thể tích nhỏ, ≤ 100 ml (tính trên mỗi bao bì) | ≥ 10 µm | 6.000 | 3.000 |
| ≥ 25 µm | 600 | 300 | |
| Thể tích lớn, > 100 ml (tính trên mỗi mililít) | ≥ 10 µm | 25 | 12 |
| ≥ 25 µm | 3 | 2 |
Hai điều rút ra từ bảng này.
Thứ nhất, giới hạn của Phương pháp 2 chặt hơn — với thể tích nhỏ là đúng một nửa. Lý do nằm ở bản chất phép đo: kính hiển vi nhìn thấy hình dạng thật của hạt và không đếm bọt khí, nên mỗi hạt đếm được là một hạt rắn thật. Che sáng đếm cả những thứ chỉ chắn sáng, nên dược điển để ngưỡng rộng hơn. Hệ quả thực tế: một mẫu đạt theo Phương pháp 1 vẫn có thể trượt theo Phương pháp 2, và điều đó không mâu thuẫn.
Thứ hai, đơn vị đổi theo dạng bao bì. Với thể tích nhỏ, giới hạn tính trên mỗi bao bì, nên phải gộp đủ số lọ để có thể tích đo và chia ngược lại. Với thể tích lớn, giới hạn tính trên mỗi mililít. Nhầm đơn vị giữa hai nhóm này là lỗi tính toán phổ biến nhất trong kiểm nghiệm tiểu phân, và là lý do phần mềm chuyên dụng tồn tại.
Khi nào buộc phải chuyển sang Phương pháp 2
Dược điển nêu nguyên tắc: khi Phương pháp 1 không áp dụng được, ví dụ chế phẩm có độ trong thấp hoặc độ nhớt cao. Diễn giải ra thực tế sản xuất, có bốn nhóm hay gặp:
| Nhóm chế phẩm | Vì sao che sáng không đọc được |
|---|---|
| Nhũ tương (lipid tiêm truyền, một số thuốc gây mê) | Giọt pha dầu phân tán chắn sáng như hạt — máy đếm chính công thức của sản phẩm |
| Hệ keo và chế phẩm liposome | Pha phân tán làm nền quang học đục, không tách được tín hiệu hạt |
| Công thức đệm bicarbonat | Giải phóng khí khi bị hút vào cảm biến, sinh bọt liên tục, khử khí không hết |
| Dung dịch quá nhớt, không pha loãng được | Lưu lượng qua buồng đo sai lệch, thể tích được soi không còn đúng như báo cáo |
Điểm chung của cả bốn nhóm: vấn đề nằm ở bản chất mẫu, không phải ở tay nghề hay ở thiết bị. Cố ép chúng qua Phương pháp 1 chỉ tạo ra một con số không có ý nghĩa mà vẫn phải lưu trong hồ sơ.
Với nhóm thứ tư, pha loãng định lượng bằng dung môi phù hợp là lối ra được dược điển cho phép trước khi tính tới chuyện đổi phương pháp — với điều kiện chứng minh được dung môi không hoà tan hay phân tán mất chính loại tiểu phân đang đếm.
Chuyển phương pháp thì phòng lab thay đổi gì
Chuyển từ Phương pháp 1 sang Phương pháp 2 không chỉ là đổi thiết bị. Nó đổi cả cấu trúc chi phí và cấu trúc rủi ro của phép thử:
- Thời gian mỗi mẫu tăng nhiều lần. Che sáng cho kết quả trong vài phút. Lọc màng, sấy, soi và đếm thủ công là công việc tính bằng chục phút tới hàng giờ cho mỗi mẫu.
- Kết quả phụ thuộc người đếm. Phán đoán ranh giới 10 µm hay 25 µm khi soi kính là thao tác chủ quan, nên phải có chương trình đào tạo, đánh giá năng lực và kiểm tra chéo giữa các kiểm nghiệm viên — những thứ mà phép đo tự động không cần.
- Rủi ro nhiễm bẩn nền cao hơn. Mẫu bị mở ra môi trường ở khâu lọc và chuyển màng. Toàn bộ thao tác phải làm trong tủ dòng khí một chiều, và mẫu trắng của quy trình lọc trở thành bắt buộc chứ không phải tuỳ chọn.
- Năng suất giảm. Một phòng QC quen chạy vài chục mẫu mỗi ca bằng hệ tự động sẽ không giữ được nhịp đó với phương pháp thủ công — điều cần tính vào kế hoạch nhân sự trước khi chuyển, không phải sau.
Vì sao Phương pháp 2 không thay thế được Phương pháp 1
Nếu kính hiển vi chính xác hơn về bản chất hạt, tại sao dược điển không lấy nó làm phép thử chính? Vì độ chính xác về bản chất không bù được ba nhược điểm:
Thống kê. Che sáng đếm được toàn bộ thể tích mẫu đi qua cảm biến, thường là hàng chục mililít, cho số đếm đủ lớn để có ý nghĩa thống kê. Đếm bằng kính hiển vi chỉ soi được diện tích màng thực tế quét qua, với một số lượng hạt hạn chế.
Độ lặp lại. Máy đọc cùng một mẫu hai lần cho kết quả gần như trùng nhau. Hai kiểm nghiệm viên soi cùng một màng thì không.
Hồ sơ điện tử. Dữ liệu che sáng sinh ra dưới dạng bản ghi có dấu thời gian, có thể gắn audit trail và chữ ký điện tử theo 21 CFR Part 11. Kết quả đếm tay đi vào biểu mẫu giấy rồi mới được nhập lại — thêm một bước chuyển dữ liệu bằng tay, tức thêm một điểm yếu khi thanh tra rà soát tính toàn vẹn dữ liệu.
Vì vậy thứ tự đúng là: giữ Phương pháp 1 làm phép thử thường quy cho mọi sản phẩm chạy được, và dành Phương pháp 2 cho đúng nhóm sản phẩm mà dược điển yêu cầu.
Chuỗi thiết bị cho Phương pháp 1
Một hệ chạy Phương pháp 1 gồm ba khối, và cấu hình khối lấy mẫu là nơi quyết định phòng lab phục vụ được những dạng bào chế nào.
Bộ lấy mẫu rút một thể tích xác định từ bao bì và đưa qua cảm biến với tốc độ ổn định. Dòng lấy mẫu xi-lanh của PMS chia theo bậc thể tích: máy lấy mẫu hạt tiểu phân trong dung dịch PMS SLS 1100 phục vụ nhóm bao bì nhỏ tới vừa như ống tiêm và lọ đơn liều, còn máy lấy mẫu hạt tiểu phân trong dung dịch PMS SLS 1300 lên bậc vừa tới lớn, phù hợp hơn với chai dung tích cao. Chọn sai bậc thì mỗi phép thử phải gộp nhiều bao bì hơn mức cần thiết, kéo theo tốn mẫu và tăng cơ hội nhiễm bẩn nền.
Máy đếm là khối thực hiện phép đo che sáng. PMS APSS 2000 là hệ lấy mẫu và đếm tự động cho USP 788 với dải đo công bố 1,5 – 125 µm, xử lý hàng loạt thay vì từng mẫu một.
Phần mềm biến số đếm thô thành kết luận. Phần mềm PMS SamplerSight điều khiển trình tự lấy mẫu, áp đúng công thức giới hạn theo dạng bao bì và kết luận đạt hay không đạt, kèm audit trail và chữ ký điện tử. Chính khối này xoá được lỗi nhầm đơn vị giữa nhóm thể tích nhỏ và thể tích lớn đã nói ở trên.
Hồ sơ phải ghi gì khi đổi phương pháp
Quyết định chuyển sang Phương pháp 2 phải để lại dấu vết, nếu không thanh tra sẽ đọc nó như một lần chọn phương pháp tuỳ tiện để tránh kết quả xấu. Bốn hạng mục tối thiểu:
- Bằng chứng Phương pháp 1 không áp dụng được cho chính sản phẩm này — dữ liệu độ nhớt, độ trong, hoặc bản ghi cho thấy mẫu sinh bọt liên tục sau khi đã khử khí đúng quy trình.
- Thẩm định Phương pháp 2 trên nền sản phẩm: mẫu trắng của quy trình lọc, đánh giá năng lực kiểm nghiệm viên, kiểm tra chéo giữa hai người đếm.
- Giới hạn áp dụng ghi rõ là bộ giới hạn của Phương pháp 2, không phải bê nguyên bộ của Phương pháp 1.
- Ngày và lý do chuyển, kèm phê duyệt của người có thẩm quyền — để khi so sánh xu hướng dữ liệu qua các năm, người đọc biết chỗ nào là điểm gãy do đổi phương pháp chứ không phải do chất lượng sản phẩm thay đổi.
Câu hỏi thường gặp
Phương pháp 1 và Phương pháp 2 trong USP 788 khác nhau ở đâu?
Phương pháp 1 đếm hạt bằng nguyên lý che sáng — mẫu chảy qua cảm biến quang học, máy đếm tự động. Phương pháp 2 lọc mẫu qua màng rồi soi và đếm thủ công dưới kính hiển vi. Phương pháp 1 là phép thử áp dụng trước; Phương pháp 2 dùng khi Phương pháp 1 không áp dụng được, ví dụ chế phẩm có độ trong thấp hoặc độ nhớt cao.
Giới hạn tiểu phân của hai phương pháp có giống nhau không?
Không. Với bao bì thể tích nhỏ từ 100 ml trở xuống, Phương pháp 1 cho phép tối đa 6.000 hạt ≥10 µm và 600 hạt ≥25 µm mỗi bao bì, còn Phương pháp 2 chỉ cho phép 3.000 và 300. Với bao bì trên 100 ml, con số tính trên mỗi mililít là 25 và 3 cho Phương pháp 1, so với 12 và 2 cho Phương pháp 2.
Sản phẩm nào bắt buộc dùng phương pháp kính hiển vi?
Nhóm hay gặp gồm nhũ tương, hệ keo, chế phẩm liposome, công thức đệm bicarbonat sinh khí khi hút vào cảm biến, và dung dịch quá nhớt hoặc quá đục không pha loãng được. Điểm chung là bản chất mẫu làm nền quang học không còn tách được tín hiệu hạt, chứ không phải do thiết bị kém.
Mẫu đạt Phương pháp 1 nhưng trượt Phương pháp 2 thì hiểu thế nào?
Không mâu thuẫn, vì hai phương pháp có giới hạn khác nhau và đo hai đại lượng hơi khác nhau. Điều quan trọng là mỗi sản phẩm chỉ áp dụng một phương pháp đã được thẩm định và ghi trong hồ sơ, kèm bộ giới hạn tương ứng. Không được chạy cả hai rồi chọn kết quả có lợi hơn.
Có cần đầu tư kính hiển vi cho phòng QC không?
Tuỳ danh mục sản phẩm. Nếu toàn bộ danh mục là dung dịch trong, tiêm truyền thông thường thì Phương pháp 1 phủ hết và không cần. Nếu có nhũ tương lipid, chế phẩm liposome hoặc công thức đệm bicarbonat thì phải chuẩn bị năng lực Phương pháp 2 — bao gồm cả tủ dòng khí một chiều, chương trình đào tạo và đánh giá năng lực người đếm, chứ không chỉ là mua kính.
Techmaster Electronics là nhà phân phối uỷ quyền của Particle Measuring Systems tại Việt Nam, có phòng thí nghiệm hiệu chuẩn được ANAB (Hoa Kỳ) công nhận theo ISO/IEC 17025. Đội kỹ thuật hỗ trợ đối chiếu dạng bào chế với khả năng áp dụng Phương pháp 1, chọn bậc thể tích bộ lấy mẫu phù hợp bao bì thực tế và cấu hình phần mềm kết luận đạt/không đạt theo đúng bộ giới hạn.
