Hạt sống (viable particle) là hạt tiểu phân mang theo vi sinh vật còn sống — vi khuẩn, nấm mốc, bào tử — có khả năng sinh sôi và làm nhiễm khuẩn sản phẩm. Hạt không sống (non-viable particle) là hạt tiểu phân trơ như bụi, sợi vải, mảnh da chết, không tự nhân lên. Trong nhà máy dược GMP, cả hai loại đều bắt buộc phải giám sát, bằng hai nhóm thiết bị và hai đơn vị đo hoàn toàn khác nhau.
Đây là một trong những cặp khái niệm dễ nhầm nhất với người mới làm giám sát môi trường (Environmental Monitoring – EM) phòng sạch. Nhiều người tưởng máy đếm hạt tiểu phân đã đo được cả vi sinh vật, hoặc ngược lại, đĩa thạch nuôi cấy đã bao quát luôn độ bụi. Cả hai cách hiểu đều sai — và sai lệch này có thể khiến toàn bộ chương trình giám sát bị đoàn thanh tra bác bỏ.
Phân biệt nhanh: hạt sống vs hạt không sống
| Tiêu chí | Hạt không sống (non-viable) | Hạt sống (viable) |
|---|---|---|
| Bản chất | Hạt tiểu phân trơ: bụi, sợi, mảnh da, khói | Vi sinh vật sống hoặc hạt mang vi sinh vật sống |
| Có sinh sôi không? | Không | Có — nhân lên nếu gặp điều kiện thuận lợi |
| Thiết bị đo | Máy đếm hạt tiểu phân quang học (light scattering) | Thiết bị lấy mẫu vi sinh + nuôi cấy trên môi trường thạch |
| Nguyên lý | Đếm và phân loại hạt theo ánh sáng tán xạ, cho kết quả tức thời | Thu vi sinh vật lên đĩa thạch rồi ủ 2–5 ngày để đếm khuẩn lạc |
| Đơn vị | hạt/m³ (theo ngưỡng ≥0,5 µm và ≥5 µm) | CFU/m³ hoặc CFU/đĩa (đơn vị khuẩn lạc – Colony Forming Unit) |
| Thời gian có kết quả | Ngay lập tức / theo thời gian thực | Sau khi ủ mẫu (thường 2–5 ngày) |
| Tiêu chuẩn nền | ISO 14644-1, ISO 21501-4 | EU GMP Annex 1, dược điển (USP/EP) về phương pháp vi sinh |
Điểm mấu chốt: máy đếm hạt tiểu phân không biết một hạt là sống hay chết. Nó chỉ đếm tổng số hạt vượt một ngưỡng kích thước. Một hạt trơ 0,5 µm và một tế bào vi khuẩn 0,5 µm cho cùng một tín hiệu tán xạ ánh sáng. Vì vậy máy đếm hạt đo tổng tiểu phân (bao gồm cả phần sống lẫn không sống), còn thiết bị lấy mẫu vi sinh mới tách riêng và định lượng được phần sống.
Vì sao lại quan tâm tới hạt sống nếu đã đo tổng hạt?
Có một mối liên hệ thống kê: phòng sạch càng ít tiểu phân thì xác suất có vi sinh vật lơ lửng trong không khí càng thấp, vì phần lớn vi khuẩn không bay một mình mà bám trên các hạt mang (bụi, giọt bắn, vảy da). Nhờ vậy, kiểm soát tốt hạt không sống là tuyến phòng thủ đầu tiên gián tiếp làm giảm nguy cơ nhiễm khuẩn.
Nhưng liên hệ đó chỉ là xác suất, không phải quan hệ một-đối-một. Một phòng có tổng hạt đạt chuẩn vẫn có thể chứa vi sinh vật vượt giới hạn — ví dụ khi thao tác viên phát tán vi khuẩn từ da hoặc hô hấp. Đó là lý do không thể suy ra mức nhiễm khuẩn chỉ từ số đếm hạt, và ngược lại. Hai phép đo bổ sung cho nhau chứ không thay thế nhau.
Vì sao EU GMP Annex 1 yêu cầu giám sát CẢ HAI
Phiên bản EU GMP Annex 1 (2022) — bộ quy định nền tảng cho sản xuất thuốc vô trùng — quy định rõ chương trình giám sát môi trường phải bao gồm đồng thời giám sát tiểu phân (total/non-viable) và giám sát vi sinh (viable). Không được chọn một, bỏ một.
Lý do nằm ở bản chất rủi ro:
- Hạt không sống là chỉ dấu về mức độ kiểm soát vật lý của phòng sạch: hiệu quả lọc HEPA, độ kín, số lần trao đổi khí, kỷ luật thao tác. Đo liên tục cho phép phát hiện tức thời khi có sự cố (lọc rách, cửa mở sai, thao tác sinh bụi).
- Hạt sống là chỉ dấu trực tiếp về rủi ro nhiễm khuẩn sản phẩm — thứ mà cơ quan quản lý quan tâm nhất đối với thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, dịch truyền.
Annex 1 2022 còn siết chặt hơn: ở khu vực Grade A, việc lấy mẫu vi sinh phải liên tục trong suốt quá trình thao tác quan trọng (trước đây chỉ yêu cầu “thường xuyên”), và kết quả kỳ vọng cho hạt sống ở Grade A là 0 CFU — bất kỳ khuẩn lạc nào mọc lên đều phải mở điều tra sai lệch. Song song, giám sát tiểu phân ≥0,5 µm cũng phải liên tục ở Grade A trong mọi thao tác quan trọng.
Đo hạt không sống bằng máy đếm hạt tiểu phân
Đây là nhóm thiết bị Techmaster phân phối chính thức của Particle Measuring Systems (PMS). Máy hoạt động theo nguyên lý tán xạ ánh sáng laser: dòng khí mẫu đi qua buồng quang, mỗi hạt cắt ngang tia laser tạo một xung sáng, cường độ xung tỉ lệ với kích thước hạt. Máy đếm số xung và phân loại theo kênh kích thước, cho ra số hạt/m³ ở các ngưỡng ≥0,5 µm và ≥5 µm.
Các dòng thực tế theo nhu cầu:
- Lasair® Pro / Lasair III — máy đếm hạt cầm tay dùng để phân loại và giám sát định kỳ phòng sạch, khảo sát điểm, kiểm tra sau bảo trì.
- IsoAir® Pro — máy đếm hạt cố định/từ xa, tích hợp vào hệ thống giám sát tự động chạy 24/7 cho các điểm cố định.
- Airnet® II — cảm biến đếm hạt lắp cố định, nối mạng nhiều điểm về một phần mềm giám sát tập trung, phù hợp giám sát liên tục theo yêu cầu Annex 1.
Để kết quả có giá trị pháp lý, máy đếm hạt phải được hiệu chuẩn theo ISO 21501-4 là gì — tiêu chuẩn quy định 8 thông số hiệu chuẩn bắt buộc cho máy đếm hạt quang học. Chi tiết cách bố trí điểm đo và số mẫu trong nhà máy dược xem tại bài đo tiểu phân nhà máy dược GMP.
Đo hạt sống: thiết bị lấy mẫu vi sinh chủ động và đĩa lắng
Giám sát vi sinh không đo tức thời được — phải thu vi sinh vật lên môi trường dinh dưỡng rồi ủ cho khuẩn lạc mọc lên và đếm. Có hai phương pháp lấy mẫu không khí chính:
1. Thiết bị lấy mẫu vi sinh chủ động (active air sampler)
Thiết bị hút một thể tích khí xác định (ví dụ 1.000 lít = 1 m³) và bắn dòng khí đó lên bề mặt đĩa thạch qua một đầu va đập (impactor). Vi sinh vật trong khí bị giữ lại trên thạch, sau khi ủ sẽ cho số khuẩn lạc, quy đổi ra CFU/m³. Ưu điểm: định lượng theo thể tích khí thực, cho con số so sánh được với giới hạn Annex 1.
Về nguyên lý giải pháp, PMS có các dòng lấy mẫu vi sinh chủ động như MiniCapt® (đầu hút di động/cố định) và họ đầu va đập BioCapt®. Cần lưu ý: đây là giới thiệu nguyên lý công nghệ của PMS, không phải chào bán — dòng đầu va đập vi sinh dùng một lần (single-use) hiện không thuộc danh mục Techmaster phân phối tại Việt Nam. Với khách hàng cần triển khai giám sát vi sinh, hãy liên hệ để được tư vấn cấu hình phù hợp thị trường.
2. Đĩa lắng (settle plate) — phương pháp thụ động
Đặt một đĩa thạch mở nắp (thường đường kính 90 mm) tại vị trí cần theo dõi và để phơi trong thời gian tối đa 4 giờ. Vi sinh vật lơ lửng lắng tự nhiên xuống mặt thạch dưới tác dụng trọng lực. Sau khi ủ, đếm khuẩn lạc cho ra CFU/4 giờ. Đĩa lắng đơn giản, rẻ, không cần thiết bị, phản ánh nguy cơ lắng đọng ngay trên bề mặt hở của sản phẩm — nên vẫn là phương pháp bắt buộc song song với lấy mẫu chủ động, đặc biệt ngay tại điểm thao tác vô trùng.
Ngoài không khí, giám sát vi sinh còn có đĩa tiếp xúc (contact plate) đường kính 55 mm để lấy mẫu bề mặt và in găng tay (glove print) để kiểm tra tay thao tác viên.
Giới hạn theo Grade A/B/C/D (EU GMP Annex 1)
Giới hạn hạt không sống — tổng tiểu phân (số hạt tối đa / m³)
| Grade | ≥0,5 µm (at rest) | ≥5 µm (at rest) | ≥0,5 µm (in operation) | ≥5 µm (in operation) |
|---|---|---|---|---|
| A | 3.520 | 20 | 3.520 | 20 |
| B | 3.520 | 29 | 352.000 | 2.930 |
| C | 352.000 | 2.930 | 3.520.000 | 29.300 |
| D | 3.520.000 | không quy định | không định trước | không định trước |
“At rest” = phòng đã vận hành nhưng không có thao tác/người; “in operation” = đang sản xuất.
Giới hạn hạt sống — vi sinh (giá trị khuyến nghị tối đa)
| Grade | Lấy mẫu khí chủ động (CFU/m³) | Đĩa lắng Ø90 mm (CFU/4 giờ) | Đĩa tiếp xúc Ø55 mm (CFU/đĩa) | In găng 5 ngón (CFU/găng) |
|---|---|---|---|---|
| A | <1 (kỳ vọng 0) | <1 (kỳ vọng 0) | <1 (kỳ vọng 0) | <1 |
| B | 10 | 5 | 5 | 5 |
| C | 100 | 50 | 25 | — |
| D | 200 | 100 | 50 | — |
Lưu ý quan trọng theo Annex 1 2022: ở Grade A, mọi giá trị đều kỳ vọng 0 CFU — thu được từ 1 khuẩn lạc trở lên là phải điều tra. Đĩa lắng dù phơi ngắn hơn 4 giờ vẫn áp dụng giới hạn trong bảng. Các mức trên là giá trị khuyến nghị; mỗi nhà máy còn phải tự thiết lập mức cảnh báo (alert) và mức hành động (action) riêng dựa trên dữ liệu thẩm định và xu hướng thực tế của mình.
Việc bố trí điểm giám sát tiểu phân trong các khu vực Grade A như isolator và RABS có yêu cầu riêng, xem thêm máy đếm hạt tiểu phân trong isolator RABS.
Câu hỏi thường gặp
Máy đếm hạt tiểu phân có đo được vi khuẩn không?
Không. Máy đếm hạt chỉ đếm tổng số hạt vượt ngưỡng kích thước dựa trên ánh sáng tán xạ, không phân biệt được hạt đó là bụi trơ hay vi sinh vật sống. Muốn định lượng vi sinh phải dùng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch.
CFU là gì và khác gì với “số hạt”?
CFU (Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc) là số khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ mẫu vi sinh, đại diện cho số vi sinh vật sống thu được. “Số hạt” (hạt/m³) là tổng số tiểu phân đo tức thời bằng máy đếm hạt, gồm cả phần sống lẫn không sống. Hai đơn vị không quy đổi trực tiếp cho nhau.
Vì sao Grade A yêu cầu 0 CFU mà vẫn cho phép tới 3.520 hạt/m³?
Vì đó là hai phép đo khác nhau. 3.520 hạt/m³ ở ngưỡng ≥0,5 µm là giới hạn tổng tiểu phân — phần lớn trong đó là hạt trơ không gây nhiễm khuẩn. Còn 0 CFU là giới hạn cho riêng phần sống. Một phòng có thể đạt cả hai cùng lúc: nhiều hạt trơ nhưng không có vi sinh vật sống nào.
Đĩa lắng có thay thế được thiết bị lấy mẫu vi sinh chủ động không?
Không thay thế, mà bổ sung. Đĩa lắng đo nguy cơ lắng đọng thụ động lên bề mặt nhưng không cho con số theo thể tích khí. Thiết bị lấy mẫu chủ động cho CFU/m³ định lượng được. Annex 1 yêu cầu dùng kết hợp nhiều phương pháp ở khu vực vô trùng.
Kết quả giám sát vi sinh có ngay không?
Không. Khác với máy đếm hạt cho kết quả tức thời, mẫu vi sinh phải ủ 2–5 ngày để khuẩn lạc mọc lên rồi mới đếm được. Đây là lý do giám sát tiểu phân liên tục đóng vai trò cảnh báo sớm, còn giám sát vi sinh xác nhận rủi ro nhiễm khuẩn.
