Dung dịch có màu làm gì với phép đếm hạt che sáng: nền hấp thụ và hai chế độ hỏng khác nhau

Cảm biến đếm hạt che sáng về bản chất là một máy đo quang: nó đọc lượng ánh sáng bị mất đi khi một hạt đi ngang chùm tia. Nếu chính chất lỏng cũng hấp thụ ánh sáng — dung dịch màu hổ phách, hoá chất có màu, chế phẩm chứa chất tạo màu hay chất chống oxy hoá bị sẫm theo thời gian — thì nền quang học mà phép đo đứng lên đã khác với nền lúc hiệu chuẩn. Bài viết tính bằng định luật Beer–Lambert xem một dung dịch màu lấy đi bao nhiêu phần trăm ánh sáng trên quãng đường vài milimét, tách hai chế độ hỏng khác hẳn nhau (mất tỷ số tín hiệu trên nhiễu, và lệch cỡ hạt), chỉ ra vì sao mắt người không phải công cụ đánh giá và vì sao pha loãng phải trả giá bằng thể tích mẫu.

Cảm biến che sáng là một máy đo quang

Trong nguyên lý che sáng (light obscuration), chùm tia đi qua một ô dòng chảy và rơi lên một đầu thu. Khi không có hạt, đầu thu nhận một mức sáng nền ổn định — gọi là I₀. Khi một hạt đi ngang chùm tia, nó chắn mất một phần diện tích chùm, và đầu thu ghi một xung sụt biên độ ΔI. Máy quy ΔI ra đường kính hạt bằng một đường chuẩn dựng sẵn với hạt chuẩn.

Điểm hay bị bỏ qua: ΔI tỷ lệ với chính I₀. Cùng một hạt che mất cùng một tỷ lệ diện tích chùm, nhưng nếu mức sáng nền chỉ còn một nửa thì biên độ tuyệt đối của xung cũng chỉ còn một nửa. Đường chuẩn của máy được dựng trong nước sạch, nơi chất lỏng gần như không lấy đi ánh sáng nào. Một dung dịch có màu thì lấy — và nó lấy trước cả khi hạt xuất hiện.

Đây là một kênh vật lý khác với kênh chiết suất. Chiết suất quyết định độ tương phản giữa hạt và môi chất; hấp thụ quyết định lượng ánh sáng còn lại để đo. Một dung môi trong suốt vẫn có thể làm hạt tàng hình vì trùng chiết suất, và ngược lại một dung dịch nước có màu vẫn giữ nguyên tương phản chiết suất nhưng làm tối cả phép đo. Hai vấn đề phải kiểm riêng.

Số học Beer–Lambert trên quãng đường vài milimét

Độ truyền qua T của một lớp chất lỏng dày L tuân theo:

T = 10^−A, với A = A_1cm × L(cm)

trong đó A_1cm là độ hấp thụ đo trên cuvet 1 cm — con số mà phòng QC vốn đã có sẵn nếu sản phẩm có chỉ tiêu độ màu hoặc phổ hấp thụ. Ô dòng chảy của cảm biến đếm hạt mỏng hơn cuvet rất nhiều, thường ở mức milimét, nên phần lớn độ hấp thụ “biến mất” khi đổi quãng đường. Đó là tin tốt — nhưng chỉ tốt đến một mức.

A1cm của mẫu	Quãng đường 1 mm: T	Quãng đường 2 mm: T
0,2	95,5 %	91,2 %
0,5	89,1 %	79,4 %
1,0	79,4 %	63,1 %
2,0	63,1 %	39,8 %
3,0	50,1 %	25,1 %
5,0	31,6 %	10,0 %

Hai điều đọc được ngay từ bảng. Thứ nhất, quan hệ là hàm mũ, không phải tuyến tính: gấp đôi quãng đường không làm mất gấp đôi ánh sáng mà bình phương phần còn lại. Thứ hai, một mẫu có A_1cm = 3 — mức mà mắt thường đã thấy màu rõ nhưng vẫn còn nhìn xuyên qua được — đã lấy đi một nửa ánh sáng trên 1 mm và ba phần tư trên 2 mm. Đó không còn là nhiễu loạn nhỏ quanh điểm hiệu chuẩn.

Hai chế độ hỏng, không phải một

Cảm biến đếm hạt trong dung dịch không phải là thiết bị thụ động trước chuyện này. Hầu hết đều có một vòng giữ mức nền: máy đọc mức sáng nền liên tục, so với một cửa sổ cho phép, và điều chỉnh khuếch đại hoặc công suất nguồn sáng để giữ nền ở giá trị thiết kế. Dòng thông số “laser reference” hay “detector level” trên bảng trạng thái chính là đại lượng này.

Vì vậy hậu quả của một nền hấp thụ rẽ làm hai nhánh hoàn toàn khác nhau, và nhánh nào xảy ra phụ thuộc vào việc vòng bù nền còn nằm trong tầm hay đã hết tầm:

	Chế độ 1 — bù nền còn hiệu lực	Chế độ 2 — bù nền hết tầm
Mức nền	Được kéo về giá trị thiết kế	Nằm dưới cửa sổ cho phép
Cỡ hạt báo cáo	Giữ đúng	Bị đọc nhỏ hơn thực tế
Hạt nhỏ nhất phát hiện được	Tăng lên (nhiễu tăng)	Tăng lên nhiều hơn nữa
Máy có báo lỗi không	Không — và không cần	Thường có, nếu ngưỡng cảnh báo được bật
Kiểu sai lệch trên số liệu	Nhiễu nền cao, đếm dư ở ô nhỏ nhất	Đếm thiếu ở mọi ô cỡ lớn

Chế độ 2 nguy hiểm hơn hẳn vì nó tạo ra sai lệch theo hướng an toàn giả: số đếm thấp đi, mẫu trông sạch hơn, và không có gì trong bảng kết quả gợi ý rằng phép đo đã trượt.

Chế độ 1 — bù nền còn hiệu lực: mất tỷ số tín hiệu trên nhiễu

Khi vòng bù nền kéo được mức sáng về giá trị thiết kế, cỡ hạt vẫn được quy đúng. Nhưng ánh sáng đã bị mất trước khi tới đầu thu thì không lấy lại được bằng khuếch đại: khuếch đại nhân cả tín hiệu lẫn nhiễu. Với nhiễu quang chi phối bởi thống kê photon, độ lớn nhiễu tỷ lệ với căn bậc hai của lượng ánh sáng thu được, nên tỷ số tín hiệu trên nhiễu tỷ lệ với √T.

Vì tín hiệu che sáng tỷ lệ với diện tích chiếu của hạt, tức với bình phương đường kính, hạt nhỏ nhất còn phân biệt được với nhiễu có đường kính tăng theo hệ số T^−1/4:

Độ truyền qua T	Tỷ số tín hiệu trên nhiễu còn	Ngưỡng nhỏ nhất nhân với	Cấu hình 2 µm hành xử như
95,5 %	97,7 %	1,01	2,02 µm
79,4 %	89,1 %	1,06	2,12 µm
63,1 %	79,4 %	1,12	2,24 µm
39,8 %	63,1 %	1,26	2,52 µm
25,1 %	50,1 %	1,41	2,83 µm
10,0 %	31,6 %	1,78	3,56 µm

Đọc bảng theo hướng thực dụng: hàm mũ một phần tư rất tha thứ. Mất 60 % ánh sáng chỉ đẩy ngưỡng lên 26 %. Với một cấu hình đo ở 10 µm hay 25 µm theo chuyên luận tiểu phân, ngưỡng nhiễu nằm quá xa bên dưới nên phần này gần như không đụng tới kết quả. Chế độ 1 chỉ thành vấn đề với các cấu hình nhạy, nơi ô nhỏ nhất vốn đã nằm sát sàn nhiễu — và ở đó nó biểu hiện thành đếm dư ở ô nhỏ nhất chứ không phải đếm thiếu.

Chế độ 2 — bù nền hết tầm: cỡ hạt bị đọc nhỏ đi

Khi mẫu tối tới mức vòng bù nền không kéo nổi mức sáng về cửa sổ thiết kế, biên độ xung tuyệt đối bị nhân với T so với điều kiện hiệu chuẩn. Máy so biên độ ấy với đường chuẩn dựng trong nước sạch, nên diện tích chiếu biểu kiến bị nhân với T, và đường kính biểu kiến bị nhân với √T:

Độ truyền qua T	Đường kính biểu kiến nhân với	Hạt 10 µm được đọc thành	Hạt 25 µm được đọc thành
79,4 %	0,891	8,9 µm	22,3 µm
63,1 %	0,794	7,9 µm	19,9 µm
39,8 %	0,631	6,3 µm	15,8 µm
25,1 %	0,501	5,0 µm	12,5 µm
10,0 %	0,316	3,2 µm	7,9 µm

Đây mới là chỗ phép thử tiểu phân bị tổn thương. Ở T = 63 %, mọi hạt 10 µm thật đều rơi xuống dưới vạch 10 µm và biến mất khỏi ô đếm quyết định kết quả. Nói ngược lại: ở điều kiện đó, ô “≥ 10 µm” thực chất đang đếm các hạt từ 12,6 µm trở lên.

Bao nhiêu hạt bị bỏ sót thì phụ thuộc phân bố cỡ hạt của mẫu. Nếu lấy một xấp xỉ thường dùng cho hạt lơ lửng — số hạt tích luỹ giảm theo bình phương nghịch đảo của đường kính — thì việc dịch ngưỡng hiệu dụng từ 10 µm lên 12,6 µm bỏ sót khoảng 37 % số hạt đáng lẽ phải được đếm. Con số này phụ thuộc mạnh vào giả định phân bố và chỉ nên dùng để thấy độ lớn của vấn đề, không phải để hiệu chỉnh số liệu.

Mắt người không đọc được bước sóng của cảm biến

Sai lầm thường gặp nhất trong phần này không nằm ở toán mà ở khâu sàng lọc: người ta nhìn lọ mẫu, thấy màu đậm, và kết luận “mẫu này chắc có vấn đề với máy đếm hạt”; hoặc thấy màu nhạt và kết luận ngược lại. Cả hai suy luận đều không có cơ sở.

Lý do: mắt người phản hồi trong vùng nhìn thấy, tập trung quanh vùng lục–vàng, còn nguồn sáng của cảm biến đếm hạt trong dung dịch là laser diode ở một bước sóng cố định do nhà sản xuất công bố — thường nằm ở phía đỏ hoặc cận hồng ngoại. Hai hệ quả trái ngược cùng tồn tại:

• Dung dịch vàng đậm có thể gần như trong suốt với cảm biến. Nhiều chất tạo màu vàng hấp thụ mạnh ở vùng lam–tím và gần như không hấp thụ ở phía đỏ. Mắt thấy đậm, cảm biến gần như không thấy gì.
• Dung dịch nhạt màu có thể tối với cảm biến. Một chất hấp thụ ở cận hồng ngoại — hoặc đơn giản là một mẫu đục nhẹ do tán xạ đa lần — làm giảm mức nền mà mắt không nhận ra.

Kết luận thực hành ngắn gọn: đại lượng cần biết là độ hấp thụ tại bước sóng của cảm biến, không phải cảm nhận màu. Phòng QC nào có máy quang phổ đều đo được con số này trong vài phút, và nó chỉ cần đo một lần cho mỗi công thức sản phẩm.

Pha loãng: cái giá trả bằng thể tích, không phải bằng thời gian

Khi nền quá tối, cách xử lý hiển nhiên là pha loãng. Vì độ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ, muốn đưa A_1cm từ 1,0 xuống 0,1 phải pha loãng mười lần. Nhưng phép pha loãng chia đều mọi thứ, kể cả hạt.

Giả sử phần mẫu chưa pha loãng cho 25 hạt ở ô ≥ 10 µm. Đếm hạt là quá trình đếm ngẫu nhiên, độ lệch chuẩn tương đối bằng 1/√N, nên 25 hạt tương ứng độ lệch 20 %. Sau khi pha loãng mười lần, cùng thể tích ấy chỉ còn 2,5 hạt — độ lệch chuẩn tương đối vọt lên 63 %. Kết quả không sai, nhưng nó không còn phân biệt được mẫu đạt với mẫu trượt.

Muốn giữ lại độ lệch 20 % phải đếm lại đủ 25 hạt, tức phải chạy gấp mười lần thể tích. Cụ thể: nếu quy trình cũ chạy 25 mL, quy trình sau pha loãng phải chạy 250 mL dung dịch đã pha — tương ứng 25 mL sản phẩm gốc. Với chế phẩm đóng lọ 2 mL, con số đó có nghĩa là gộp hơn một chục lọ cho một phép thử.

Ba hệ quả kéo theo, đều nên được viết vào quy trình chứ không để người thao tác tự xoay xở:

1. Mẫu trắng của dung môi pha loãng trở thành nhân vật chính. Sau khi pha loãng mười lần, chín phần mười thể tích đi qua cảm biến là dung môi pha loãng. Độ sạch của nó phải thấp hơn hẳn giới hạn chấp nhận, và phải được đo trong cùng buổi chứ không dùng số liệu cũ.
2. Thời gian chạy tăng theo thể tích. Ở lưu lượng cảm biến 20 mL/phút, 250 mL mất khoảng 12,5 phút chạy liên tục cho một phép thử, chưa kể tráng rửa giữa các mẫu.
3. Hệ số pha loãng phải đi vào phép tính, và phải kiểm được. Đây là chỗ bảng tính thủ công hay sai dấu chấm; phần mềm điều khiển bộ lấy mẫu ghi hệ số pha loãng vào cùng bản ghi với số đếm thô là cách giữ vết an toàn hơn.

Với chế phẩm sinh học còn một ràng buộc nữa: pha loãng có thể làm dịch chuyển cân bằng của các tập hợp protein. Phần đó thuộc phạm vi chuyên luận dành riêng cho thuốc tiêm protein và đã được bàn ở bài về USP <787> cho thuốc tiêm sinh học.

Bốn phép kiểm tra trước khi tin con số trên mẫu có màu

Bốn bước dưới đây tốn tổng cộng chưa tới một buổi cho mỗi công thức sản phẩm, và chỉ phải làm lại khi công thức đổi.

Phép kiểm	Làm gì	Đọc kết quả thế nào
1. Độ hấp thụ tại bước sóng cảm biến	Đo A1cm của mẫu ở đúng bước sóng nhà sản xuất công bố cho cảm biến	Quy về quãng đường ô dòng chảy bằng bảng ở mục 2 để có T ước tính
2. Mức nền khi mẫu đang chảy	Đọc thông số mức nền / laser reference trên bảng trạng thái trong lúc mẫu màu đi qua, không phải lúc chạy nước	Còn trong cửa sổ cho phép → chế độ 1; ra ngoài → chế độ 2, kết quả không dùng được
3. Hạt chuẩn trong chính nền mẫu	Cho một lượng hạt chuẩn đã biết cỡ vào mẫu placebo có màu, chạy như mẫu thật	Cỡ đọc được lệch bao nhiêu so với danh nghĩa — đây là phép đo trực tiếp của hiệu ứng, không cần mô hình
4. Đối chiếu pha loãng	Chạy mẫu ở hai mức pha loãng, quy về nồng độ gốc	Hai con số hội tụ → nền không chi phối; càng pha loãng càng ra nhiều hạt → nền đang che

Phép kiểm số 3 là phép mạnh nhất và cũng ít được làm nhất. Nó biến toàn bộ phần lý thuyết ở trên thành một con số đo được của chính cặp sản phẩm × cảm biến đang dùng, và là bằng chứng thuyết phục nhất khi phải giải trình với kiểm toán viên vì sao phòng lab tin kết quả trên một nền không giống nền hiệu chuẩn.

Về phía cấu hình thiết bị, nhóm hoá chất có màu và nền hấp thụ mạnh thường đi cùng các cảm biến thiết kế cho môi chất khó: PMS UltraChem 40 và PMS UltraChem 100 cho hoá chất quy trình, còn nền nước sạch dùng làm mốc đối chứng thì thuộc về nhóm PMS Ultra DI 20 Plus. Với chế phẩm đóng lọ cần kiểm soát thể tích từng phần mẫu, bộ lấy mẫu xi-lanh như PMS SLS 1100 giữ cho hệ số pha loãng và thể tích thật đi cùng nhau trong một bản ghi.

Ranh giới của mô hình

Phần toán ở trên có bốn giả định cần nói thẳng, vì bỏ qua chúng là cách nhanh nhất để biến một công cụ suy luận thành một hệ số hiệu chỉnh sai:

• Beer–Lambert giả định hấp thụ thuần tuý. Mẫu đục làm mất ánh sáng chủ yếu do tán xạ, và tán xạ hành xử khác — nó vừa làm giảm nền vừa làm tăng nhiễu nền, nên thực tế xấu hơn bảng.
• Quãng đường quang học thật không bằng bề rộng ô dòng chảy. Chùm tia đi qua thành ô, qua lớp chất lỏng, rồi ra; nhà sản xuất mới biết con số chính xác. Hai giá trị 1 mm và 2 mm trong bài là mốc để ước lượng.
• Hành vi của vòng bù nền là đặc tính riêng của từng dòng cảm biến. Tầm bù, tốc độ bù và ngưỡng báo lỗi khác nhau giữa các model; chỉ tài liệu kỹ thuật của chính thiết bị mới trả lời được máy đang ở chế độ 1 hay chế độ 2.
• Bài này không đề xuất sửa số liệu. Mọi bảng ở trên dùng để quyết định có tin phép đo hay không và phải kiểm thêm gì, không dùng để nhân chia kết quả đã đo.

Điểm cuối đáng nhấn lại: đây là hiệu ứng chung của nguyên lý che sáng, không phải đặc điểm của một hãng nào. Mọi máy đếm hạt trong dung dịch đều dựng đường chuẩn bằng hạt chuẩn trong nước, nên mọi máy đều chịu cùng phép quy đổi khi nền đổi. Khác biệt giữa các dòng nằm ở tầm bù nền và ở việc thiết bị có báo cho người dùng biết mình đã ra ngoài cửa sổ hay không.